Il 13 maggio 2024, in provincia di Pavia, ha avuto inizio la prima sperimentazione italiana in campo aperto di piante di riso ottenute mediante TEA, le innovative Tecniche di Evoluzione Assistita per la produzione di piante migliorate geneticamente.

28 metri quadrati: questa l’area destinata alla prima fase della sperimentazione. Un fazzoletto di terreno circoscritto, che però segna un notevole passo avanti per la genetica e le biotecnologie agrarie in Italia. Questa è infatti la prima volta che, dopo 20 anni di stop, nel nostro Paese si è tornati a sperimentare in campo aperto una varietà di pianta prodotta in laboratorio: un traguardo reso possibile dal Decreto Siccità, che è stato approvato dal governo italiano nel 2023. Purtroppo, a poco più di un mese dalla messa a dimora, nella notte tra il 20 e il 21 giugno 2024, le piante del campo sperimentale sono state sradicate e distrutte da ignoti. La sperimentazione però non si ferma.

In questo articolo spieghiamo che cosa sono le TEA e come siamo arrivati a questo traguardo. Ce lo racconta in questa intervista Vittoria Brambilla, professoressa di botanica presso l’Università di Milano e responsabile del progetto insieme a Fabio Fornara, professore del Dipartimento di Bioscienze dello stesso Ateneo.

Quali sono le caratteristiche del riso Ris8imo?

Ris8imo – così è stata battezzata la nuova varietà di riso messa a punto dall’Università di Milano – è stata migliorata per ridurre la sua suscettibilità al brusone, una delle patologie più temute dai coltivatori di riso.

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Il brusone (o rice blast, in inglese) è causato da un’infezione del fungo patogeno Magnaporthe grisea (o Pyricularia oryzae), che a livello globale è considerato tra i dieci patogeni più pericolosi per le coltivazioni: un problema che riguarda da vicino l’Italia, visto che il nostro Paese è il maggiore produttore di riso in Europa. L’infezione porta alla comparsa di macchie romboidali di colore rossastro che danneggiano le foglie e le pannocchie coi semi, compromettendo il raccolto.

Le attuali strategie per contrastare il brusone prevedono pratiche agronomiche o l’uso di agrofarmaci che però hanno dei limiti di efficacia e tossicità per l’ambiente. Le modifiche genetiche introdotte nel riso Ris8imo hanno l’intento di diminuire la suscettibilità della pianta all’infezione.

Quali modifiche genetiche sono state introdotte nel riso Ris8imo?

Per diminuire la suscettibilità al brusone, nelle piantine di Ris8imo sono stati inattivati 3 geni: Pi21, HMA1 e HMA2.

Pi21 è un gene associato all’infezione del fungo Magnaporthe grisea. Il meccanismo con cui il prodotto del gene Pi21 favorisce l’infezione non è ancora noto, ma nella letteratura scientifica sono stati descritti esempi di varietà naturali che, grazie a delezioni e mutazioni spontanee a carico del gene Pi21, manifestano una maggiore resistenza al brusone. Per questo, Pi21 è stato fin da subito in cima alla lista dei potenziali bersagli genetici da inattivare per cercare di ottenere varietà di riso resistenti al brusone.

Pi21 non è però l’unico gene responsabile della suscettibilità al brusone: studi successivi hanno permesso di identificare altri due geni, HMA1 e HMA2: per questo motivo, per minimizzare il rischio di infezione, nelle piantine di Ris8imo sono stati inattivati tutti e tre questi geni.

Come è stato eseguito l’editing del genoma con TEA?

Le TEA o Tecnologie di Evoluzione Assistita sono biotecnologie che consentono di ottenere una specifica caratteristica – come la resistenza al brusone nel caso di Ris8imo – senza introdurre transgeni derivati da altre specie. Di fatto, le TEA tendono a replicare – accelerandolo e rendendolo più preciso – il processo che in natura porta alla comparsa di mutazioni spontanee: per questo motivo, si parla di «evoluzione assistita».

Per ottenere la modifica desiderata con le TEA si possono utilizzare diversi metodi, ma uno dei più versatili è senza dubbio quello basato sull’editing del genoma con CRISPR.

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Nel caso specifico di Ris8imo, CRISPR ha permesso di introdurre nel genoma del riso degli indels, cioè delle brevi inserzioni o piccole delezioni che si trovano comunemente nei genomi e che nel nostro caso hanno permesso di inattivare i tre geni che contribuiscono a rendere le piante di riso suscettibili al brusone.

Per capire come agisce questo sistema di editing genomico, rivediamo in breve il meccanismo di funzionamento del sistema CRISPR/Cas9. CRISPR agisce tagliando il DNA a doppio filamento del genoma del riso e innesca così il consueto processo di riparazione del DNA con cui le cellule si difendono dai danni al genoma. Una di queste vie di riparazione, chiamata NHEJ (Non Homologous End Joining), non è un meccanismo preciso al 100% e spesso porta alla introduzione di brevissime inserzioni o delezioni (parliamo di una o al massimo poche basi), chiamate indels. Gli indels alterano la sequenza originaria e, se compaiono all’interno della regione codificante di un gene, possono causare una mutazione di frameshift e la conseguente inattivazione del gene. Inattivazione che, in situazioni sperimentali specifiche, può essere proprio l’obiettivo ricercato: è questo il caso del riso resistente al brusone, in cui i tre geni Pi21, HMA1 e HMA2 sono stati inattivati con l’inserimento di indels.

Parlare di questi aspetti tecnici è importante per capire come si sono evolute le tecniche di editing del genoma negli ultimi 10 anni, ma aiuta anche a comprendere meglio perché – rispetto al veto imposto in passato alla sperimentazione di piante geneticamente modificate (GM) – oggi sia stato possibile ottenere l’autorizzazione alla sperimentazione in campo di piante modificate con le TEA.

Come sottolinea Vittoria Brambilla:

Con l’arrivo delle tecnologie TEA è stato possibile generare piante simili ai prodotti ibridi tradizionali: le modifiche inserite sono simili a quelle che avvengono nei genomi spontaneamente.

In passato, la coltivazione di piante GM – anche solo a scopo di ricerca – è sempre stata vietata nel nostro Paese. Ma il modo in cui sono state ottenute le piante di Ris8imo è diverso per almeno tre motivi:

1. non sono stati usati transgeni, cioè sequenze geniche provenienti da altre specie, che invece erano un tratto distintivo delle prime generazioni di piante GM;
2. non sono state introdotte nuove sequenze: con CRISPR sono stati inattivati in modo mirato tre geni già presenti nelle piante di riso ma non è stata introdotta alcuna nuova funzione;
3. le mutazioni indotte dall’introduzione di indels sono simili a quelle che si verificano spontaneamente in natura e che contribuiscono alla generazione di nuove varianti alleliche in una popolazione: le TEA hanno quindi permesso semplicemente di accelerare i tempi di generazione di varietà che si sarebbero potute formare spontaneamente anche in natura.

Come si è arrivati alla sperimentazione in campo di Ris8imo?

Per le piante modificate geneticamente, i test di laboratorio sono fondamentali ma non bastano: la vera prova del nove è la sperimentazione in condizioni naturali, cioè in campo aperto. Una prova che, negli ultimi 20 anni, è stata ostacolata da una normativa molto stringente che impediva la messa a dimora all’aperto – anche per scopi sperimentali – di piante modificate geneticamente.

Grazie al Decreto Siccità, nel 2023 si è aperta la possibilità di eseguire la sperimentazione in campo aperto su alcune specifiche categorie di piante geneticamente modificate, tra cui le piante migliorate con TEA basate su CRISPR. Nel Decreto Legge Siccità del 14 aprile 2023 si legge:

Per consentire lo svolgimento delle attività di ricerca presso siti sperimentali autorizzati, a sostegno di produzioni vegetali in grado di rispondere in maniera adeguata a condizioni di scarsità idrica e in presenza di stress ambientali e biotici di particolare intensità [...] l'autorizzazione all'emissione deliberata nell'ambiente di organismi prodotti con tecniche di editing genomico mediante mutagenesi sito-diretta o di cisgenesi a fini sperimentali e scientifici è soggetta, fino al 31 dicembre 2024, alle disposizioni di cui al presente articolo.

Per la varietà Ris8imo, l’opportunità offerta dal Decreto Siccità si è trasformata in realtà nel maggio del 2024, quando sono state messe a dimora le piantine per i primi test sul campo. Grazie all’aiuto di patologi vegetali, sarà possibile verificare se le modifiche inserite nel genoma sono efficaci anche in ambiente naturale, cioè se sono in grado di preservare le piante dall’attacco del fungo in misura maggiore rispetto a quanto osservato nelle piante non modificate geneticamente.

Quali saranno i prossimi passi?

Il permesso alla sperimentazione, inizialmente valido fino alla fine del 2024, è stato esteso a tutto il 2025 per permettere al gruppo di ricerca di ripartire con un nuovo campo sperimentale dopo che il primo è stato distrutto da ignoti. Nel caso di risultati positivi, Vittoria Brambilla auspica che il permesso alla sperimentazione venga esteso ad altre varietà di riso TEA resistenti al brusone e ad altre zone, in modo da testare la resistenza ai diversi ceppi di fungo Magnaporthe grisea, che possono variare in base alle regioni, alle condizioni climatiche o alle piante coltivate nei dintorni.
Una eventuale estensione del permesso permetterebbe inoltre di testare varietà vegetali resistenti non solo ai patogeni, come sottolinea Vittoria Brambilla:

Negli ultimi anni è cambiata l’attenzione della politica e della società verso la genetica agraria: il cambiamento climatico ha portato allo scoperto dinamiche e problemi che 20 anni fa non erano così evidenti.

Tra i principali stress non infettivi ci sono la siccità e lo stress salino: due problemi che, in futuro, potrebbero riguardare da vicino molte coltivazioni del nostro Paese a causa del cambiamento climatico e dell’innalzamento del livello del mare.

immagine di copertina: Shutterstock

Confronto tra NHEJ e HDR (Credit: Guido4/Wikimedia Commons)

Una pianta di riso colpita dal brusone (immagine: Shutterstock)