Al di là dell’occhio umano. Come funzionano i microscopi

“Uno studioso al microscopio vede molto più di noi. Ma c’è un momento, un punto, in cui anch’egli deve fermarsi. Ebbene, è a quel punto che per me comincia la poesia”.
René Magritte

In realtà, il punto a cui si riferisce il pittore belga in quest’intervista del 1951 si è rivelato non essere un muro invalicabile, ma è andato spostandosi nel tempo verso dimensioni sempre minori. E il microscopio, lo strumento comparso nei primi anni del 1600 segnando in modo indelebile la storia della medicina e della biologia, permette oggi all’occhio umano di spingersi verso i limiti dell’infinitamente piccolo.

Nel 1665 lo scienziato Robert Hooke pubblica Micrographia, con il quale fa scoprire al resto della comunità scientifica il micromondo e le potenzialità del microscopio. A lui va la paternità della definizione di “cellula”, osservata per la prima volta in una sezione di sughero. Il libro è ricco di tavole illustrate dettagliatissime. Qui lo potete scaricare e sfogliare.

Hooke-Microscope-cork

Il microscopio utilizzato da Hooke e l’illustrazione delle cellule vegetali osservate in una sezione di sughero (Immagine: Wikimedia Commons)

A riconoscimento di questo ruolo fondamentale nello sviluppo della conoscenza, il premio Nobel per la Chimica nel 2014 è andato proprio a tre microscopisti. Vedremo tra poco che non si è trattato di un caso unico.

 

Quali sono i limiti dell’occhio umano che rendono necessari i microscopi?

Il microscopio è uno strumento che permette di risolvere, cioè riesce a dare immagini dei più piccoli dettagli, e ingrandire oggetti che non sono visibili a occhio nudo. Anche l’occhio umano, se vogliamo, può essere considerato come un sofisticato strumento ottico, in quanto formato da una lente, il cristallino, in grado di proiettare le immagini sulla retina. Il cristallino ha una curvatura che può essere modificata dalla contrazione dei muscoli ciliari per mettere a fuoco oggetti più o meno vicini.

Il sistema di lenti presenti nel nostro occhio non è esente da difetti. La miopia, per esempio, è dovuta a un allungamento del bulbo oculare che impedisce la corretta messa a fuoco dell’immagine sulla retina. 

Quando vogliamo osservare un oggetto molto piccolo, l’istinto ci porta ad avvicinarlo agli occhi, ma c’è una distanza minima – 250 mm – oltre cui il nostro occhio non può più avere una “visione distinta” dell’oggetto a causa della limitata elasticità del cristallino. Per sopperire a questo limite fisiologico dell’occhio ci si deve avvalere di strumenti in grado di ingrandire l’oggetto grazie a un sistema di lenti, i microscopi appunto. L’ingrandimento, cioè il rapporto tra le dimensioni dell’oggetto originale e quelle dell’immagine ottenuta, è una delle caratteristiche che definisce un microscopio.

Un altro limite dell’occhio umano riguarda il potere di risoluzione, ovvero il limite oltre il quale non riusciamo più a vedere come distinti due punti vicini tra loro, limite che per noi si aggira intorno a 0,1 mm, pari a 100 micrometri. Considerando quali siano le dimensioni medie delle cellule (qualche decina di micrometri), è facile comprendere come senza uno strumento in grado di andare oltre il potere di risoluzione dell’occhio umano molte delle pagine degli attuali libri di biologia non sarebbero state scritte. Al microscopio, nato per soddisfare la curiosità e il desiderio di conoscenza dell’uomo, va quindi il merito di aver “migliorato” l’occhio umano fino a renderlo capace di distinguere dettagli, strutture e caratteristiche della materia che altrimenti sarebbero rimaste sconosciute.

Per approfondire come funziona e come si usa il microscopio ottico, includiamo un breve video tratto dalle risorse multimediali di Phelan, Pignocchino, Le scienze naturali (Zanichelli 2015):

 

Cos’è e come funziona un microscopio ottico?

I primi strumenti utilizzati dai pionieri della microscopia furono i microscopici ottici, attualmente ancora i più diffusi. In questo tipo di strumento il campione da osservare viene attraversato dalla luce visibile. L’ingrandimento dell’immagine viene determinato dall’obiettivo, un doppio sistema di lenti convergenti che raccoglie la luce proveniente dal campione e la restituisce ingrandita all’osservatore. Generalmente i microscopi ottici sono dotati di obiettivi con ingrandimenti che variano dai 4X (cioè l’immagine restituita è 4 volte più grande del reale, o “quattro per”) ai 100X, ma i microscopi ottici più sofisticati possono arrivare anche a ingrandire un oggetto 1500 volte. Il potere di risoluzione di un microscopio ottico è di 0,2 micrometri, in accordo con il principio di Ernst Abbe che spiega come la risoluzione di un microscopio sia inversamente proporzionale alla lunghezza d’onda della luce. Nonostante questo limite, il microscopio ottico permette di osservare batteri e cellule di tessuti animali o vegetali e addirittura i mitocondri.

Meristemo_apical_1

Meristema apicale di cipolla osservato al microscopio ottico (Immagine: Wikipedia)

A oggi esistono molti tipi di microscopi ottici, sviluppati in base a specifiche esigenze. Il microscopio ottico a contrasto di fase, per esempio, sfrutta il fenomeno dell’interferenza luminosa. Molti campioni biologici, come le cellule, sono composti soprattutto di acqua, trasparente alla luce visibile. Quando invece la luce colpisce un organello cellulare la radiazione luminosa subisce un cambiamento di fase (diverso in base allo spessore della struttura) che viene registrato dal microscopio e che dà informazioni utili circa la composizione delle cellule. La tecnica è valsa il premio Nobel per la fisica nel 1953 a Frits Zernike e permette di osservare cellule in vita e addirittura in movimento (come gli spermatozoi) senza usare coloranti o fissativi che altererebbero la loro morfologia.

Il microscopio ottico a fluorescenza sfrutta una sorgente luminosa che trasmette radiazioni a bassa lunghezza d’onda nel visibile e permette di visualizzare i campioni grazie alle loro proprietà fluorescenti acquisite dopo il trattamento con opportuni “coloranti”. Si tratta di molecole con speciali affinità per uno o più componenti della cellula. Possono essere naturalmente fluorescenti o coniugati con un fluorocromo e, una volta colpite dalla radiazione luminosa, emettono una frazione dell’energia assorbita. Questo tipo di microscopio è molto utile per studiare nei dettagli la morfologia dei campioni. Esistono, infatti, coloranti specifici per i nuclei delle cellule, come il colorante Hoechst o l’arancio di acridina, in grado di legare e rendere “fluorescenti” gli acidi nucleici. Altre molecole possono essere visualizzate utilizzando anticorpi specifici con una “coda” fluorescente. In questo modo si può visualizzare la distribuzione, per esempio, di una specifica proteina all’interno della cellula.

HeLa_cells

A sinistra: cellule HeLa osservate attraverso un microscopio ottico a contrasto di fase. A destra: cellule endoteliali viste attraverso un microscopio ottico a fluorescenza: in blu i nuclei, in verde i microtubuli e in rosso i filamenti di actina. (Immagini: Wikimedia Commons)

La GFP (Green Fluorescent Protein) è una proteina isolata dalla medusa Aequorea victoria. Il suo segno particolare? Essere “naturalmente fluorescente”. Se eccitata da una radiazione a una specifica lunghezza d’onda, è in grado infatti di riemettere luce di colore verde. Oltre alla versione “naturale” ne esistono altre 7 varianti, con differenti caratteristiche di emissione.

Qui si può leggere un testo sulla sua importanza e qui si trova uno dei tanti studi dove è stata utilizzata.

GFP

Disegno ottenuto su una piastra di Petri strisciando colture batteriche contenenti diverse forme di GFP (Immagine: Wikimedia Commons).

I tre vincitori del Nobel per la chimica dello 2014 hanno avuto il merito di elaborare una tecnica di microscopia a fluorescenza, chiamata miscroscopia a super risoluzione, in grado di abbattere il principio di Abbe e portare quindi un microscopio ottico a poteri di risoluzione su scala nanometrica.

Dal laboratorio di Eric Betzig, uno dei padri della microscopia a super risoluzione, arriva un’altra tecnica di microscopia all’avanguardia per studiare i dettagli interni di una cellula in un modo più “dolce”, senza alterarne le strutture e la funzione. Ne abbiamo parlato in questo articolo.

 

Cos’è e come funziona un microscopio elettronico?

Nonostante i recenti sviluppi tecnologici dei microscopi ottici, questi strumenti restano tuttavia inadatti a studiare le complesse strutture interne delle cellule. Un aiuto in questo senso viene dal microscopio elettronico, nato nel 1931 per mano di Ernst Ruska (premio Nobel per la Fisica nel 1986 assieme a Gerd Binnig e Heinrich Rohrer) e Max Knoll. Il microscopio elettronico utilizza un fascio di elettroni al posto della luce visibile e le lenti sono sostituite da elettromagneti che deviano il fascio di elettroni ottenendo così l’ingrandimento e la messa a fuoco dell’immagine.  Gli elettroni “sparati” dallo strumento verso il campione da analizzare possiedono una lunghezza d’onda molto inferiore rispetto ai fotoni che compongono la luce. Secondo il principio di Abbe, quindi, il potere di risoluzione è maggiore e può infatti arrivare fino a 0,2 nanometri, cioè mille volte più piccolo di quello di un microscopio ottico. L’ingrandimento ottenuto grazie a questi microscopi, inoltre, può arrivare a mostrare all’osservatore il campione 100 mila volte più grande del reale. Per essere opportunamente analizzati con il microscopio elettronico i campioni devono essere minuziosamente preparati secondo specifici protocolli che “fissano” le cellule. A differenza dei microscopi ottici, quindi, non è possibile osservare cellule o campioni vivi.

Il microscopio elettronico a scansione (o SEM) funziona come un vero e proprio scanner. Il campione viene ricoperto con una sottile lamina metallica che riflette gli elettroni che lo urtano e che vanno a formare una vera propria copia in 3D della struttura esterna del campione. Questo tipo di analisi è utile per studiare gli elementi di superficie del campione, come le membrane cellulari.

Il microscopio elettronico a trasmissione (o TEM), invece, fornisce immagini bidimensionali della struttura interna del campione con un potere risolutivo ancora più elevato. Sono osservabili, per esempio, proteine e lipidi, piccoli reticoli atomici di carbonio o il DNA sui cromosomi.

electon_microscopy

 A sinistra: Il virus del vaiolo osservato al microscopio elettronico a trasmissione. A destra: il microscopio elettronico a scansione rivela la grande diversità dei granelli di polline (Immagine: Wikimedia Commons).

 

Come saranno i microscopi del futuro?

La sfida è costruire microscopi più potenti e capaci di spingersi a poteri di risoluzione sempre inferiori. In Italia esistono alcune tra le punte di diamante della microscopia ottica del futuro, strumenti raffinati e potenti in grado di migliorare significativamente la ricerca in ambito medico.

All’Istituto Italiano di Tecnologia di Genova è stata messa a punto una versione implementata della microscopia su singola molecola o “supervista” (la stessa oggetto del Nobel 2014 per la chimica). Si tratta di una tecnica che permette di visualizzare, attraverso un sistema di impulsi laser, le stesse molecole fluorescenti di cui abbiamo parlato prima ma con il grossissimo vantaggio di poter eliminare tutto il rumore di “fondo”. La fluorescenza analizzata, cioè, viene solo da un solo punto preciso del campione (una singola molecola, per l’appunto) e questo permette livelli di precisione nanometrici, tanto da rendere visibili singole proteine. La cosa interessante permessa da questo strumento è quella di poter monitorare le singole molecole nel corso del tempo e in campioni più spessi di quelli consentiti dai normali microscopi. Le applicazioni nella biologia di base sono innumerevoli e ancora più interessanti sono i futuri risvolti applicativi che questa tecnica potrebbe avere nella pratica medica. Per esempio, potrebbe rendere possibile effettuare delle biopsie “molecolari” incredibilmente fini e dettagliate direttamente in sala operatoria durante un intervento o monitorare in tempo reale l’effetto di un farmaco o un trattamento.

Sempre in Italia, nei laboratori dell’Istituto di nanoscienze del CNR di Lecce, è stato collaudato CAT, un microscopio che unisce tre diversi microscopi in un unico strumento: un microscopio confocale, un microscopio a forza atomica e un microscopio a riflessione interna. L’utilizzo combinato di questi tre permette di vedere contemporaneamente tre aspetti importanti di una cellula: il volume, la superficie e il suo stato di salute. Il tutto a dettagli nanometrici. Le sue applicazioni attuali riguardano soprattutto lo studio di nano-farmaci antitumorali, ma sarà utilizzato anche come una “lente” speciale per scovare precocemente e con super precisione cellule tumorali in studi diagnostici.

E la microscopia elettronica? Difficile dire dove ancora può arrivare, dal momento che esistono già microscopi in grado di vedere atomiparticelle subatomiche e in grado di indagare l’antimateria. Di sicuro, la storia degli strumenti per indagare l’infinitamente piccolo non finisce qui.

Immagine box: Pixabay

Immagine banner: Flickr

 

Per la lezione

Prosegui la lettura

Commenti

Lascia un commento

Il tuo indirizzo email non sarà pubblicato. I campi obbligatori sono contrassegnati *